核酸提取纯化常见问题

A. 使用翼飞雪任何产品，都需要严格按照翼飞雪产品说明书进行操作。

B. DNA/RNA/蛋白提取，产物量（观察现象）与产物纯度始终是一对矛盾。

C. 提取之前，先仔细阅读说明书，重点查阅说明书中黑体加粗的提示。

Q1：提取质粒加入B uffer 3之后，提高离心速度和离心时间，对于提取产物有何影响？

A1：加入Buffer 3之后提高立新速度和离心时间确实有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温

下离心时间过长会使液体温度升高，造成质粒降解。一般情况下可以4℃、12000rpm离心

10min，或者常温下12000rpm离心3-4min即可。

 

Q2：琼脂糖凝胶回收时，如回收DNA片段过短怎么样处理？

A2: 如果回收DNA片段小于500bp时，为了提高回收效率，可以在加入凝胶液溶解凝胶

后，加入1.5倍体积凝胶块体积的异丙醇，并充分颠倒混匀。

 

Q3: 琼脂糖凝胶回收时，如何处理凝胶液溶胶后的颜色异常？

A3: 凝胶液完全溶胶后，正常颜色应该是浅黄色。如果颜色变为红色或者橙色之后，需要加入5μl 5M NaAc（pH5.2）调节溶液的pH值，是混合物的颜色恢复为正常的浅黄色（如不调节pH值，会影响DNA的回收率）。

 

Q4: 基因组DNA提取的时候，如何确定裂解液体积与样品质量的关系：

A4：理论上，裂解液的体积越大、样品的量越少，提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值，仅供参考。

动物组织：5-10mg	贴壁细胞：10cm2	悬浮细胞：5× 106数量
人血液：100-300 μl	小鼠血液：50-100 μl	植物组织：30mg
土壤：300mg	粪便：10mg	革兰氏阴性菌：1ml
酵母、革兰氏阳性菌、丝状真菌：10mg
复杂样品（食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物）：300mg

 

Q5: 基因组DNA提取时，采取哪些方法可以提高产物得率？

A5-1：适当加大裂解液体积与样品质量的比例。

A5-2：洗脱液提前预热至65℃ 左右，同时洗脱液上柱时要小心加到吸附膜的中间部位，并确保液体将膜全部覆盖。

A5-3: 样本裂解后的混合液上柱时如体积过大，需要分次上柱，并且确保每次上样量不超过700μl。

A5-4：适当延长组织的匀浆和裂解时间。

 

Q6：提取产物的A260/A280比值较高的原因？

A6：纯净的DNA的A260/A280比率在1.8-2.0之间，如样品中RNA的残留量较多，则会造成A260/A280的比较较高，需要在提取过程中加入RNase A（如提取过程中按照说明书加入了RNase A，则要考虑RNase活性降低的可能性）。

 

Q7: 血液基因组DNA提取之前的样本处理注意事项？

A7-1: 人血液中含有大量可能干扰下游DNA分析的酶抑制剂，另外诸如干扰素、EDTA等通用的抗凝剂还会干扰下游检测。因此从人血液中分离DNA时，需要具备可提供不含污染物和酶抑制剂的优质DNA的方法。

A7-2： 哺乳动物的红细胞中不含有核酸，但健康的哺乳动物血液中红细胞含量要超过含有核酸的白细胞（包括淋巴细胞、单核白细胞、颗粒性白细胞等）近1000倍，因此在提取基因组DNA之前去除红细胞可提高DNA产量，推荐方法如下：

A7-2-1：选择性溶解红细胞：在低渗缓冲液条件下，红细胞会较早低渗休克和快速破裂。

A7-2-2：Ficoll密度梯度离心法，可回收单核细胞（淋巴细胞和单核细胞）并去除红细胞（此方法还可去除粒细胞）。

A7-2-3：室温下对全血进行3300g离心10min，离心后会分成三层：上清层为质粒；中间层为白细胞层；底层含有浓缩的红细胞。

A7-3：鸟类、鱼、青蛙的红细胞含有核酸，因此不需要处理红细胞。

A7-4: 血液样本（包括经过红细胞去除处理的血液样本），可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。

A7-5：除动物基因组DNA外，也可以从血液中分离病毒和细菌DNA。

 

Q8：总RNA提取的时候，如何确定裂解液和样本量的关系？

A8: 理论上，裂解液的体积越大、样品的量越少，提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值，仅供参考。

动物组织：50-100mg	贴壁细胞：10cm2	悬浮细胞：5× 106数量
人血液：100-300 μl	小鼠血液：50-100 μl	植物组织：50mg
土壤：300mg	粪便：10mg	革兰氏阴性菌：1ml
酵母、革兰氏阳性菌、丝状真菌：10mg
复杂样品（食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物）200mg

 

Q9：总RNA提取时样本的处理方式？

A9-1：理论上越新鲜的样本，提取的总RNA质量越好。如果不能及时提取，需要使用液氮迅速冷冻样本，然后一直储存于-80℃条件下。 样本的反复冻融对于提取RNA的质量有很大的影响。

A9-2：破碎：组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同的样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。  

A9-3：匀浆：匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能切断高分子量的基因组DNA以及其它高分子量的细胞组分，得到均匀的裂解产物。匀浆不彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。

A9-4：不同样本处理方法建议

样本来源	破碎方法	匀浆方法	建议
动物培养细胞	加入裂解缓冲液	使用转子-定子匀浆机或注射器和针头获取胞质RNA	如细胞数量少于1×105，可使用涡动匀浆裂解产物，不建议匀浆方案。
动物组织	转子-定子匀浆机	转子-定子匀浆机	同步进行破碎和匀浆
	研钵和杵	注射器和针头	使用转子-定子匀浆机和玻珠研磨机通常比使用研钵和杵的得率更高。
	玻珠研磨机	玻珠研磨机
细菌	加入裂解缓冲液	涡旋机	如果处理大于5×108个细胞，使用注射器和针头进行匀浆可能会提高产率。
	玻珠研磨机	玻珠研磨机	不能使用涡动操作代替。
酵母	酶解（溶菌酶/消解酶）细胞壁后加入裂解缓冲液	涡旋机
	玻珠研磨机	玻珠研磨机	不能使用涡动操作代替。
植物和丝状真菌	研钵和杵	注射器和针头	研钵和杵不能代替转子-定子匀浆机。

 

Q10：RNA提取后如何定量？

A10-1：检测RNA样本时，需确保比色杯中去除了RNA酶，特别是测定之后仍需回收这些RNA的情况下（操作方法可按照通过使用0.1M NaOH、1mM EDTA和不含RNase水的顺序来依次洗涤）。

A10-2：使用紫外通透塑料比色杯的分光光度计时，测量A260的吸光值时，读数应该在0.15-1.0之间，A260波长下，1个单位的吸光值对应44μg/ml的RNA浓度（这一相关性仅对中性pH值条件下的检测有效。因此如需稀释RNA样品，应使用如pH7.0、10mM Tris HCl的中性pH值的低盐缓冲液。）

A10-3：RNA定量举例

RNA样品体积=100μl

稀释=10μl RNA样品+490μl 10mM Tris HCl，pH7.0（稀释倍数1:50）

使用1ml去RNA酶的比色杯，检测稀释后样本的吸光度

A260=0.2

 

RNA浓度

=44μg/ml × A260 × 稀释倍数

= 44μg/ml × 0.2× 50

=440μg/ml 

Q11：提取产物低

A11-1：没有使用平衡液平衡柱膜。

 

A11-2：样品裂解不充分：

-样品与裂解液必需充分混匀

-增加裂解液：样品的体积质量比

-动物组织处理前切成尽量小的小块

 

A11-3：样品质量不好

-样品尽可能新鲜（如植物组织越嫩越好）

-样品采集后如不能及时提取，需尽快-70℃或者液氮储存

-样品避免反复冻融

 

A11-4：离心柱堵塞

过柱前裂解液混合物应呈现清澈，如有浑浊应离心去除

 

A11-5：洗脱条件需要优化

-使用试剂盒的洗脱液进行洗脱，尽量不使用超纯水洗脱

-使用超纯水洗脱，必需调节值pH7.0-8.5

-洗脱液提前在65℃温浴1-2min，对提高DNA产量极有帮助

-洗脱液要添加在柱膜中央，且全部覆盖柱膜

 

A11-6：部分样品需要添加蛋白酶K（如鼠尾组织）

-试剂盒中没有此成分，如大客户需要，可以赠送（使用方法与使用量参考其他公司）

Q12：DNA影响后续酶切反应

A12：洗脱液YWS(Wash Solution)中的乙醇有残留

   -加入YWS离心后，再次离心的步骤切不可省略。

 

Q13：DNA降解

A13：-样本不新鲜

   -液氮研磨时有回潮现象

 

Q14:提取基因组DNA产物A260/A280的值较高（正常比值为1.8-2.0）

A14：提取产物中RNA含量较高

   -提取过程中加入RNase A，如大客户需要，可以赠送（使用方法与使用量参考其他公司）

 

Q15：使用质粒小提试剂盒时，加入YS3缓冲液之后，提高离心速度和离心时间之后，对于提取产物有什么影响？

A15：-加入YS3之后提高离心速度和离心时间，会有助于沉淀贴壁更为紧密，但常温下离心时间过长会导致液体温度升高，导致质粒降解，因此一般情况下4℃、12000rpm离心10min，或者常温下12000rpm离心3-4min即可。

 

Q16：琼脂糖凝胶回收时，如回收片段过短怎么处理？

A16：-任何品牌的胶回收试剂盒，对于过小或过大的DNA片段，回收效率都会降低。如回收片段过小（＜500bp），可以在溶胶后加入溶胶液1.5倍体积的异丙醇，充分颠倒混匀后，进行下一步操作。

 

Q17：琼脂糖凝胶回收时，如溶胶后溶胶液的颜色出现橙色或者红色怎么处理？

A17：-凝胶液完全溶胶后，液体颜色应该是浅黄色。如果颜色变为橙色或者红色，需要加入5µl 5M NaAc（pH5.2）调节溶液的pH值，使液体的颜色恢复为正常的浅黄色。

   -如不调整pH值，会对DNA的回收率有明显的影响。