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荧光定量PCR常见问题

发布时间：2017-11-29　浏览次数：4367

Q1：荧光信号升高太高，杂乱无章，看上去像扩增失败，超出检测范围？

A1：该现象主要表现在ABI仪器系列，原因主要是ROX浓度较低，对于ABI系列，除ABI 7500和ABI 7500FAST之外，ABI系列仪器应都使用高浓度ROX染料。

Q2：高浓度模板，Ct值却更低，甚至检测不到？

A2：该现象是因为模板含量太高，信号出现早，与仪器基线设置不匹配的原因。可通过A:稀释模板； B: 修改数据分析时的基线设置，使基线的循环数小于小于样品的Ct值。

Q3：阴性对照有扩增，但多个阴性对照的Ct值大小不等，熔解曲线呈单峰。

A3：反应体系被污染。具体有3个可能：

A3-1：模板交叉污染：需要使用带滤芯的吸头；

A3-2：PCR产物气溶胶污染：反应体系中加入UNG酶/dUTP(会增加实验成本）；将反应体系的准备与产物跑胶在不同场所进行。

A3-3：反应体系下的其它组分被污染：换用新的组分。

Q4：阴性对照有扩增，多个阴性对照的Ct值类似，熔解曲线有多个峰

A4：有引物二聚体。可通过如下方法解决：

A4-1：降低引物浓度至0.1μM。

A4-2：将PCR扩增程序由两步法改为三步法。

A4-3：重新设计引物。

Q5：熔解曲线有2个或者2个以上的峰

A5：反应特异性差；有引物二聚体或者其他非特异性扩增。可通过如下方法解决：

A5-1：降低引物浓度至0.1μM。

A5-2：将PCR扩增程序由两步法改为三步法。

A5-3：重新设计引物。

Q6：ΔRn⠼font face="宋体" >不超过1，在低水平徘徊

A6-1：⠼font face="宋体" >无扩增：无模板的阴性结果、引物问题、组分加错等原因。

A6-2：样品中模板含量太高：稀释模板

A6-3： C_T值出现太早：修改数据分析时的基线设置，使基线的循环数小于样品的C_T值。

A6-4：与仪器设置不匹配。

Q7：标准曲线斜率绝对值大于4，扩增效率低于90%

A7-1：模板中含有PCR反应抑制因子，反应被抑制：将模板进行稀释，或者重新提取RNA，或者春花cDNA。

A7-2：难扩增模板：PCR扩增阶段采用三步法，延长延伸时间，调整镁离子浓度等。

A7-3：引物问题：换用其它引物进行PCR反应，如其它引物无此问题，则说明是引物问题。改变扩增条件可能有改善，如仍无改善，需要重新设计引物。

A7-4：模板稀释错误：重新稀释模板。

Q8：标准曲线斜率绝对值小于3，扩增高于110%

A8-1：非特异性扩增：降低引物浓度；改变退火温度；重新设计引物。

A8-2：引物二聚体：降低引物浓度，重新设计引物。

A803: 模板稀释错误：重新稀释模板。

Q9：标准曲线R²小于0.98

A9-1：标准曲线的个别点结果有误：检查CT值的最大点和最小点是否超过检测范围，只有在线性范围内定量才是准确的。

A9-2：模板稀释错误：重新稀释模板。