YFX-CLM062
1×106cells/T25培养瓶
￥2500
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货号 |
YFX-CLM062 |
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背景描述 |
1948年三月建立了NCTC clone 929(小鼠结缔组织)，细胞系L的克隆。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，而clone 929是最早的克隆株。从一只100日龄的雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松结缔组织入脂肪组织中建立了亲本细胞系L。 第95代的细胞系L使用毛细管法分离单细胞建立了clone929。检测发现鼠痘病毒阴性。该细胞通过慢病毒转染的方式携带GFP基因。 该细胞为已经构建好稳定转染GFP的细胞，随细胞传代次数的增加，其GFP荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度，可以加入嘌呤霉素进行再次筛选。 建议收到细胞后至少传3代，冻存留种后再进行筛选。 初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度为1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2μg/mL嘌呤霉素的完全培养基继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5μg/mL。若筛选过程中，漂浮细胞大于60%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5μg/mL嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完全培养基正常培养。 |
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细胞形态 |
成纤维细胞样，贴壁生长。 |
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规格 |
>1x106 细胞数量，T25瓶或者1mL冻存管包装。 |
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细胞来源 |
小鼠 皮下结缔组织；疏松结缔组织及脂肪 品系：C3H/An。 |
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培养基 |
MEM＋10% 马血清＋1% P/S。注：该细胞不能使用胎牛血清培养。 |
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培养条件 |
气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。 |
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消化时间 |
37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间）。 |
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传代比例 |
1:2-1:5；第一次收到细胞建议T25培养瓶1：2传代。 |
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换液频率 |
2-3天。 |
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细胞冻存液 |
90% 马血清或完全培养基，10%DMSO，现用现配。 |
1、收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
2、请在4或5×显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。
3、贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4、备注：运输用的培养基不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。
1、收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。
2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）
置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4mL含10%FBS的培养基来终止消化。
3、将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpmL离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8mL按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；
1、选择指数生长期的细胞，吸去培养液，加PBS清洗1-2遍。去PBS，加入0.25% 胰酶1.5mL润洗10秒，去胰酶。将培养瓶放37度培养箱，靠残余胰酶继续消化细胞直至细胞变圆，拍打瓶侧使细胞脱落。细胞消化下来后，加5mL培养液全部吹打下来，再1000RPM离心3分钟。
2、加入1-1.5mL成品冻存液，分装至2mL冻存管里，将冻存管放入充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃度冰箱过夜，第二天再转至液氮。
1、将恒温水浴锅中的水预热到37℃。
2、准备一支15mL 离心管，加入5mL 完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热。
3、戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率。
4、将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min。
5、准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4mL 完全培养基。
6、离心完成后弃去上清，用 1mL 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入CO2 培养箱中培养静置。
1、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
2、从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
