一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（橙红色，Cy3）

产品简介

翼飞雪一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（橙红色，Cy3）提供了一种检测细胞和组织在凋亡过程中细胞核DNA断裂程度的方法，Ex/Em = 550/570nm。  

细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的DNA内切酶，这些内切酶会将核小体间的基因组DNA切割成180-200bp的整数倍片段，暴露出基因末端的3'-OH。在正常或增殖的细胞中，几乎没有 DNA 断裂， 因此 3'-OH 的形成很少。TdT酶(脱氧核糖核酸末端转移酶)将绿色荧光标记的dUTP连接到断裂DNA 暴露的3'-OH末端，从而可以在荧光显微镜下进行检测。 

本试剂盒可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞的凋亡情况。

实验案例

1、细胞爬片样本：

1.1 样本预处理

A. 在所需合适大小的孔板中，用TC处理的细胞爬片培养贴壁细胞，经过凋亡诱导处理后，用PBS漂洗载玻片2次。

B. 加入过量的4%多聚甲醛，完全浸没爬片，4℃ 静置25min，进行细胞固定。

C. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

D. 加入过量的0.2% Triton X-100，室温通透5min。

注：优先推荐使用Triton X-100进行通透，也可使用Proteinase K（用PBS稀释Proteinase K，至其终浓度为20μg/mL）进行通透：在每个样本上滴加100μL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液完全覆盖样本，室温孵育5min（此为推荐时间，具体最佳时间须自行摸索）。通透时间最长不得超过15min。

E. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

1.2 阳性对照（可选）

A. 准备避光湿盒，底部倒入一层水，平展的铺上一层洁净的保鲜膜。

B. 用ddH2O将10 ×DNase I Buffer稀释至1 ×，滴加100μL的1 ×DNase I Buffer至湿盒内的保鲜膜上，将细胞爬片从孔板中取出，细胞面向下盖住1 ×Nase I Buffer，室温平衡5min。

C. 用1 ×DNase 1 Buffer将DNase 1稀释至其终浓度为20U/mL，在保鲜膜上滴加50μL终浓度为20U/mL的DNase I。

D. 取出细胞爬片，轻轻吸干多余水分，细胞面向下盖住20U/mL的DNase I，37℃孵育10min。

E. 取出细胞爬片，细胞面向上放入洁净的孔板中，用过量的PBS洗涤3次，每次洗涤5min。

注：阳性对照必需使用单独的染色缸或者孔板，阳性对照上残余的DNase 1可能会在实验组中造成假阳性的错误信号。

1.3 标记及检测

A. 准备避光湿盒，，底部倒入一层水，平展的铺上一层洁净的保鲜膜。

B. 用ddH2O将5 ×反应缓冲液稀释至1 ×，滴加100μL的1 ×反应缓冲液至保鲜膜上，将细胞爬片从孔板中取出，细胞面向下盖住1 ×反应缓冲液，室温平衡5min。

C. 平衡期间，在冰浴和避光条件下按照下表配制标记液：

D. 平衡结束后，将标记液50μL滴加到洁净的保鲜膜上，取出爬片，用吸水纸吸干多余的液体，盖住相应的标记液，注意避光。

注：标记液体积对于面积小于5cm2的反应，所需体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT标记反应液的总体积。对于表面积更大的样本，可按照比例增加试剂体积。

E. 盖紧湿盒盖子，注意避光，防止爬片干燥，37℃孵育60min。

F. 取出爬片，轻轻去掉多余的液体，放入新的孔板中，用新鲜的PBS溶液清洗2次，每次5min。

注：如果背景过高，样本在用PBS清洗后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5min，这样可以将游离的未反应标记物清除干净。

G. 在载玻片上滴加1滴抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）。

H. 取出爬片，用吸水纸轻轻吸掉周围的溶液，盖住载玻片的抗荧光淬灭封片剂（含DAPI），并进行封片。

I. 立即在荧光显微镜下分析样本，在激发/发射波长为492/517nm下观察绿色荧光，或在激发/发射波长为356/451nm下观察DAPI的蓝色荧光。

2、细胞涂片样本：

2.1 样本预处理：

A. 细胞涂片：按照2 ×106 ceLLs/mL的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取50-100μL细胞悬浮液涂片在多聚赖氨酸包被的载玻片上，晾干。

B. 将涂片浸入装有4%多聚甲醛的染色缸中，4℃ 放置25min进行细胞固定。

C. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

D. 将涂片浸没于0.2% Triton X-100溶液中，室温通透5min。

注：优先推荐使用Triton X-100进行通透，也可使用Proteinase K（用PBS稀释Proteinase K，至其终浓度为20μg/mL）进行通透：在每个样本上滴加100μL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液完全覆盖样本，室温孵育5min（此为推荐时间，具体最佳时间须自行摸索）。通透时间最长不得超过15min。

E. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

F. 轻轻吸去多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

2.2 阳性对照（可选）

A. 准备避光湿盒，底部放入用水浸湿的纸巾，载玻片全部转移到湿盒中。

B. 用ddH2O将10 ×DNase I Buffer稀释至1 ×，滴加100μL的1 ×DNase I Buffer至已通透的样本上，室温平衡5min。

C. 用1 ×DNase I Buffer将DNase I稀释至其终浓度为20U/mL，轻轻吸干载玻片的多余液体，每个阳性对照样品滴加100μL终浓度为20U/mL的DNase I，37℃孵育10min。

D.  轻轻吸干载玻片上的多余液体，用PBS溶液清洗2-3次，每次5min。

注：阳性对照必需使用单独的染色缸或者孔板，阳性对照上残余的DNase I可能会在实验组中造成假阳性的错误信号。

2.3 标记及检测

A. 底部放入用水浸湿的纸巾，载玻片全部转移到湿盒中。

B. 用ddH2O将5 ×反应缓冲液稀释至1 ×，滴加100μL的1 ×反应缓冲液至湿盒内的样品上，室温平衡5-10min。

C. 平衡期间，冰浴和避光条件下按照下表配制标记液：

D. 平衡结束后，用吸水纸吸干多余的液体，在样本上滴加50μL的标记液，注意避光。

注：标记液体积对于面积小于5cm2的反应，所需体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT标记反应液的总体积。对于表面积更大的样本，可按照比例增加试剂体积。

E. 盖紧湿盒的盖子，注意避光，防止样本干燥，37℃孵育60min。

F. 轻轻吸去多余液体，用新鲜的PBS溶液清洗2-3次，每次5min。

注：如果背景过高，样本在用PBS清洗后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5min，这样可以将游离的未反应标记物清除干净。

G. 用吸水纸轻轻擦掉样本周围的液体，样本上滴加1滴抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）。

H. 用盖玻片盖住载玻片的抗荧光淬灭封片剂（含DAPI），进行封片。

I. 立即在荧光显微镜下分析样本，在激发/发射波长492/517nm下观察绿色荧光； 或在激发/发射波长356/451nm下观察DAPI的蓝色荧光。

3、石蜡包埋组织切片样本：

3.1 样本预处理

A. 室温下将切片浸入二甲苯脱蜡2次，每次5-10min，以彻底脱掉石蜡。

注：二甲苯有毒且易挥发，请在独立设置的实验室或者通风橱中进行。低温可能会影响二甲苯脱蜡效果，当室温低于37℃时，可将脱蜡时间延长至20min。

B. 室温下将切片浸入无水乙醇浸泡润洗2次，每次5min。

C. 室温下依次将切片浸入90%、80%、70%乙醇各一次，每次3min。

D. 用PBS浸泡润洗切片，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

E. 用PBS将Proteinase K溶液稀释至终浓度为20μg/mL，每个样本上滴加100μL稀释后的Proteinase K溶液，让溶液覆盖全部样本区域，37℃孵育15-30min（不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索）。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。 Proteinase K通透时间过长可能会导致组织切片在后续步骤中从载玻片上脱落；过短可能会导致通透处理不充分，影响标记效率。建议进行预实验，确定反应时间。

D. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

注：务必要把Proteinase K清洗干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

3.2 阳性对照（可选）

参考细胞涂片样本操作步骤。

3.3 标记及检测

参考细胞涂片样本操作步骤。

4、冰冻组织切片样本：

4.1 样本预处理

A. 将冰冻切片长置于长架上，室温晾干20min。

B. 将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液中，室温固定30min。

C. 轻轻去掉多余液体，并用吸水纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

D. 用PBS浸泡润洗切片2次，每次5min。用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

E. 每个样本滴加每个样本上滴加100μL浓度为0.2%的Triton X-100溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育15-30min。如果通透效果不好，用PBS稀释Proteinase K溶液至其终浓度为20μg/mL。每个样本滴加100μL稀释后的Proteinase K溶液，让溶液覆盖全部样本区域，37℃孵育10-30min（不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索）。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。 Proteinase K通透时间过长可能会导致组织切片在后续步骤中从载玻片上脱落；过短可能会导致通透处理不充分，影响标记效率。建议进行预实验，确定反应时间。

F. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。用滤纸吸干样本周围液体。

注：务必要把Proteinase K清洗干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

4.2 阳性对照（可选）

参考细胞涂片样本操作步骤。

4.3 标记及检测

参考细胞涂片样本操作步骤。

注意事项

1、5 ×反应缓冲液含有表面活性剂，所以在细胞涂片/切片样本的载玻片上滴加会扩散流失，建议实验开始前用Pan Pen圈出染色区域。

2、5 ×反应缓冲液使用前，室温静置至其完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现结晶，，此为正常现象，使用前涡旋混匀。

3、Cy3-dUTP Mix和TdT Enzyme应避免反复冻融和涡旋操作。Cy3-dUTP Mix使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解后离心，用吸头吹打混匀。TdT Enzyme对温度敏感，请严格保存于-20ºC，使用前取出，使用后立即放回。

4、配制标记工作液和阳性对照DNase 1时，建议不要涡旋。

5、实验过程中请保持样本的湿润，防止干片造成失败。

6、本说明书中的推荐条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验的结果，对样本处理时间、试剂浓度等条件进行优化，选择合适的实验条件。